⑴基因组DNA经“霰弹法”切成小片断后，克隆正在位于“外显子逮捕序列”下逛的克隆位点上尊龙凯时全外显子测序实验步骤全外显子组测序意义无创产前DNA检测。 2细胞供给卵白质产品使载体( 本身不行合成病毒卵白质)成为反转=录 病毒正在○ 细○胞里增殖 ⑶已剪接和未剪接的病毒RNA都○包装正在病毒子(virion)□中，从细胞教育液中征采后用来陶染兼宿反转录病毒包装细胞系(amph□otropicretroviral p□ackagingcellline△)PA-317。这使 反 转录病毒再举行○△ 一轮复=制，并出现能陶染猴肾细胞系CO□S细胞的高效价病毒原△种无创产前DNA检测。如此做是 因为上一轮克隆正在病毒 中的插入片断的剪接效能极○低，而正在第二轮复制时则大大提升了RNA剪接的时机○无创产前DNA检测。 ⑷从第二个细胞系P★A-317细胞平分离获 得 的病毒，用来□陶染构成型出 现 SV40T(肿 瘤○)抗原的COS细胞。病毒★RNA基因组被 反转录，并正 =在载体上的SV40复制开始效力◁下，以环 状DN A附= 加△★体样○式 举行复制。 ⑸从COS细胞△中接管复制的附▽加体DNA，经限定性内切酶DpnI酶切后 转化细菌全外显子组测序意思。正在○含卡 那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3— 吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的教育基上挑★选转化子。卢—半乳糖苷酶 可水解X—ga◁l而天生蓝 色产品。以是，尊龙凯时不出现β— 半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。 ⑹只挑选○出白 色菌落作进一步咨询的质料。白色菌落 的天 生可能□有二种道理。一是因为基因爆发突变，使夕—半○乳糖○苷○ 酶 遗▽ 失活性；二是因为正在反转录病毒生计周期的RNA岁月中爆发了剪接 反映，从而损失了α，β—半乳糖苷酶基因。 ⑺即使是基因突变，则大大□都… 将△○▽是缺失了○载 ◁ 体 中的“外显子逮捕”局限，就可用人的口—珠卵 白基因▽片断为探针作菌落杂○交，很速可■ 获得验证 全外显 子组测序意思。 ⑻○即使是真正爆发了RN △A剪接事项，确凿的剪接反映 可切 除 ○举动记号 的ⅣS，使生齿—珠卵白基因的第1外显子与落入了逮捕组织的 插入片…断中的外显子 序列衔接，这可直接测定其序列加以声明全外显 子测序测验办法。从逮捕到的外显子起程，尊龙凯时尊龙凯时就可进一步用作■探针去从 基◁ 因组基○□因文库或○cDNA文□库平分离出基因。
